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Monogalactopyranosides de fluorescéine et ester méthylique de fluorescéine : synthèse, hydrolyse enzymatique par la β-galactosidase biotnylée et détermination du coefficient de diffusion translationnelle

Les monoglycosides de fluorescéine (d-galactopyranoside (FMG) et d-glucopyranoside) et leur ester méthylique (MFMG) ont été préparés à partir d'acétobromoglucose/galactose et d'ester méthylique de fluorescéine avec de bons rendements.Des expériences d'hydrolyse enzymatique (utilisant la β-galactosidase biotinylée) des dérivés de galacto ont été réalisées et les paramètres cinétiques ont été calculés.Une augmentation de 15 à 20 fois de l'intensité de la fluorescence a été observée au cours de l'hydrolyse.Une augmentation linéaire de la fluorescence a été notée à temps court et à faible concentration de substrat, faisant de ces composés des sondes utiles et sensibles pour les galactosidases.L'amplitude de la valeur de la constante de Michaelis – Menten (Km) pour MFMG est supérieure à celle de FMG, ce qui suggère un éventuel changement de conformation du substrat fluorogène.La valeur de Km pour la β-Gal biotinylée avec FMG est inférieure à celle de l'enzyme native.Cette observation indique une plus grande affinité pour le substrat de l'enzyme biotinylée par rapport à l'enzyme native.Les coefficients de diffusion translationnelle ont été mesurés, à la fois pour les substrats fluorogènes et pour les deux produits, en utilisant la spectroscopie de corrélation de fluorescence.Les coefficients de diffusion translationnelle pour les substrats fluorogènes et les produits d'hydrolyse enzymatique ont été mesurés comme étant similaires, dans la plage de 3,5 à 4,5 × 10−10 m2 s−1.Ainsi, une amélioration ou un retard de la cinétique enzymatique dû à une différence de mobilité translationnelle du substrat et du produit n'est pas aussi apparent.