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L'analyse des événements de phosphorylation à l'échelle du protéome reste un défi analytique majeur en raison de l'énorme complexité des réseaux de phosphorylation des protéines.Dans ce travail, nous évaluons la complémentarité de Lys-N, Lys-C et de la trypsine en ce qui concerne leur capacité à contribuer à l'analyse globale du phosphoprotéome.Une version raffinée de l'échange de cations forts à faible pH a été utilisée pour séparer efficacement les peptides N-terminaux acétylés, phosphorylés et non modifiés.Un total de 5036 phosphopeptides non redondants ont pu être identifiés avec un taux de fausse découverte de <1% à partir de 1 mg de protéine en utilisant une combinaison des trois enzymes.Nos données ont révélé que le chevauchement entre les ensembles de données de phosphopeptides générés avec différentes protéases était marginal, alors que le chevauchement entre deux ensembles de données tryptiques générés de manière similaire s'est avéré être au moins 4 fois plus élevé.De cette manière, l'utilisation parallèle de Lys-N et de trypsine a permis une augmentation de 72 % du nombre de phosphopeptides détectés par rapport à la trypsine seule, alors qu'une expérience de répétition de trypsine n'a entraîné qu'une augmentation de 25 %.Ainsi, en nous concentrant uniquement sur les données de trypsine et Lys-N, nous avons identifié 4671 phosphopeptides non redondants.Une analyse plus approfondie des sites détectés a montré que les ensembles de données Lys-N et trypsine étaient enrichis en motifs de phosphorylation significativement différents, ce qui prouve en outre que les approches multiprotéases sont très utiles dans les analyses de phosphoprotéome.